Сэнджер и его сотрудники избрали инсулин первым объектом своих исследований по определению последовательности аминокислот в молекуле белка с последующим структурным анализом.
Установлено, что мономелринсулина (М. В. = 6000) состоит из двух полипептидных цепей; на N-конце одной из них (цепь А) находится глицил, а на N-конце другой (цепь В) — фенилаланил. Эти полипептидные цепи, связанные между собой в натпвном инсулине дисульфидными мостиками, можно разделить путем фракционированного осаждения при различных рН, предварительно разрушив дисульфидные мостики окислением надмуравышой кислотой. Последовательность аминокислот в фенилаланиновой цепи инсулина следующая:
(1)Фен–(2)вал–(3)асп–(4)глу–(5)гис–(6)лей–(7)цис–(8)гли–(9)сер–(10)гис–(11)лей-(12)валь (13)глу–(14)ала–(15)лей–(16)тир–(17)лей -(18)вал (19)цис–(20)гли–(21)глу–(22)арг–(23)гли–(24)фен–(25)фен–(26)тир–(27)тре–(28)про–(29)лиз-(30)ала.
В 1953 г. Сэнджер и Томпсон описали структуру второй (глициновой) цепи инсулина:
(1)Гли-(2)илей-(3)вал-(4)глу-(5)глу-(6)цис-(7)цис-(8)ала-(9)сер-(10)вал-(11)цис-(12)сер-(13)лей-(14)тир-(15)глу-(16)лей (17)глу-(18)асп-(19)тир-(20)цис-(21)асп.
Пространственная (трехмерная) структура инсулина
Положение амидогрупп определяли при помощи высоковольтного электрофореза фрагментов инсулина, полученных в результате частичного разрушения цепей А и В протеолитическими ферментами. Оказалось, что амидогруппы располагаются у остатков глутаминовой кислоты 5 и 15 в цепи В и 4 в цепи А, а также у остатков аспарагиновой кислоты — 3 в цепи А и 18 — в цепи В.
Следующим этапом в изучении первичной структуры молекулы инсулина было определение типа связи между полуцистиновыми остатками в двух цепях. Для этого было использовано расщепление при помощи протеолитических ферментов и кислотный гидролиз в условиях, при которых он не действует на дисульфидную связь. Дисульфидная связь внутри цепи была обнаружена между полуцистиновыми остатками в положениях 6 и 11 в цепи А. Сами цепи также оказались связаны друг с другом дисульфиднымп связями, соединяющими остаток 7 цепи А с остатком 7 цепи В и остаток 20 цепи А с остатком 20 цепи В.
Структура инсулина.
Аналогичные исследования, проведенные с инсулином, полученным от разных видов животных, показали, что инсулины быка, свиньи, овцы, лошади и кита сходны и имеют лишь некоторые различия, касающиеся остатков 8, 9 и 10 в цепи А. Как показано ниже, эти видовые различия сводятся исключительно к различию в компонентах внутреннего кольца в цепи А.
В последние годы большое внимание уделяется проблеме «высшей организации» белков, т. е. изучению способа взаимосвязи полипептидных цепей белка, каждая из которых характеризуется определенной последовательностью аминокислот. Как известно, именно результатом этой взаимосвязи полипептидных цепей является уникальная структура активной белковой молекулы.
Многочисленными исследованиями, обсуждение которых не входит в задачу настоящего обзора, установлено, что во многих белках полипептидный остов молекулы характерным образом свертывается, образуя так называемую а-спираль Полинга — Кори. Эта структура весьма устойчива благодаря наличию водородных мостиков между карбоксильными и имидными группами, расположенными друг против друга. Белок, в участках молекулы которого полипептидная цепь свернута в а-спираль. называют белком с вторичной структурой.
Изменения во вторичной структуре белка обычно сопровождаются значительными изменениями некоторых физических свойств, в том числе главным образом вязкости, способности к замене атомов водорода дейтерием и оптических свойств.
Термин «третичная структура» характеризует свертывание на более высоком уровне, не всегда ведущее к образованию правильной формы. При этом свертываются сами а-спирали, в результате чего сближаются некоторые боковые цепи, находящиеся далеко друг от друга в основной полипептидной цепи. Критерием такой третичной взаимосвязи могут служить изменения спектра, возникающие при формировании и разрыве водородной связи между фенольным гидроксилом остатка тирозила и β-или Υ-карбоксильной группой. Наилучшим средством выявления трехмерной структуры молекулы белка является рентгенологический структурный анализ.
Мы не будем здесь обсуждать подробно различные конфигурации, которые предлагались для объяснения строения молекулы инсулина, в частности потому, что до сих пор эту проблему нельзя считать окончательно решенной. Наличие дисульфидных мостиков противоречит предположению о том, что молекула инсулина имеет строение правильной спирали и поэтому Ходжкин и Оттон склонны были остановить свой выбор скорее на структуре, которая носит название «структура сложенного гармошкой листа», нежели на а-спирали. Другие исследователи, в частности Лау, Линдли и Ролетт. Арндт и Рили, и Линдерстрём-Ланг представили модели молекулы инсулина, основу которых все же составляет спиральная конфигурация. В последней модели цепь В представлена в виде левозакрученной спирали, а цепь А — в виде правозакрученной, причем внутренние дисульфидные петли цепи А располагаются беспорядочно.
На рисунке приведена, быть может, несколько неточная в деталях модель Линдерстрема-Ланга.
Гипотетическая модель молекулы инсулина